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表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍

2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
    不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí)，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長(zhǎng)軸方向前進(jìn)（Rm>0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時(shí)，也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。
3、電泳方法
（1）凝膠類型
    用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時(shí)，凝膠板*浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統(tǒng)
    缺少離子時(shí)，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會(huì)大量產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L（pH7.5~7.8）。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長(zhǎng)期貯存會(huì)出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點(diǎn)，室溫下貯存5×溶液，用時(shí)稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
    以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配制與加樣
    DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25％溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
    瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí)，較大的DNA片段遷移率的增加相對(duì)較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的zui大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。
    電泳系統(tǒng)的溫度對(duì)于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒(méi)有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5％時(shí)，為增加凝膠硬度，可在4℃進(jìn)行電泳。
（6）染色和拍照
    常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

SDS-PAGE膠制備

一. 實(shí)驗(yàn)原理：
SDS-PAGE是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量化，比較及特性鑒定的一種經(jīng)濟(jì)、快速、而且可重復(fù)的方法。該法是依據(jù)混合蛋白的分子量不同來(lái)進(jìn)行分離的。
SDS是一種去垢劑，可與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其廣泛存在于一個(gè)廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的長(zhǎng)度與其分子量成正比。在樣品介質(zhì)和凝膠中加入強(qiáng)還原劑和去污劑后，電荷因素可被忽略。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。
二. 試劑和器材：
試劑：1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（pH6.8）,5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍(lán)，0.9ml蒸餾水?？稍?℃保存數(shù)周，或在－20℃保存數(shù)月。
2. 凝膠貯液：在通風(fēng)櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過(guò)濾后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1個(gè)月。
3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％過(guò)硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）
7. pH8.3 Tris-*電極緩沖液：稱取Tris 6.0g，*28.8g，加蒸餾水約900ml，調(diào)pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4℃保存，臨用前稀釋10倍。
8. 考馬斯亮藍(lán)G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過(guò)氯酸，zui后補(bǔ)足水到250ml，攪拌1小時(shí)，小孔濾紙過(guò)濾。
器材：電泳儀，電泳槽，水浴鍋，搖床。

三. 實(shí)驗(yàn)操作；
（一）樣品制備
將蛋白質(zhì)樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個(gè)Eppendorf管中混合。放入100℃加熱5－10min，取上清點(diǎn)樣。
（二）分離膠及濃縮膠的制備1 將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH₂O沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說(shuō)明書提示裝好玻璃板；
3 按如下體積配制10％分離膠8.0 ml，混勻；
ddH₂O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；
5 按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml，混勻；ddH₂O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
7 裝好電泳系統(tǒng)，加入電極緩沖液，上樣20 μl;
8 穩(wěn)壓200V，溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時(shí)，停止電泳，約需45 min～1hr.
9 卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2 hr；加入脫色液，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸餾水）至*脫凈。