熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求及制作方法

熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求

(一)載玻片

載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。

(三)標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。

三、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

(4)檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)　省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

(6)標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。

(7)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光?！?+”—可見有明亮的熒光?！?++”—可見耀眼的熒光。

四、熒光圖像的記錄方法

熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

標(biāo)本的制作方法

樣品須經(jīng)過石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以.

作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

石蠟切片的過程：

1. 取材: 刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜. 取材時(shí)間越快越好.

2. 固定: 組織取下后應(yīng)立即放入10%福爾馬林(相當(dāng)于4%甲醛)固定.

注意: (1). 固定液量應(yīng)為組織塊體積的40倍.

(2) 固定時(shí)間固定時(shí)間與使用的固定液種類和組織塊大小, 溫度等有關(guān). 一般為3—24h.

(3)固定溫度大多可在室溫固定, 在低溫(4℃)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng).

(4)固定容器應(yīng)大些.

3. 漂洗: 流水沖洗2—10h.

4. 脫水: 從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數(shù)分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→99%(60-120’)→99%(60-120’).

5. 透明: 組織塊脫水后必須經(jīng)過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑, 而使石蠟進(jìn)入組織塊. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蠟: 組織經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟. 一般需經(jīng)2—3次浸漬才能完成, 總時(shí)間為3—4h. 用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52—56℃.

7. 包埋: 先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入. 包埋面必須平整. 包埋后石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片: 修塊→切片→展片→撈片→烤片.

也可作冰凍切片.

熒光染料的配制：

儲(chǔ)藏液：1mg/ml dapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時(shí)須避光，10min左右

用pbs沖去多余染液即可觀察。