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在單細(xì)胞基因組學(xué)研究中，準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞核質(zhì)量至關(guān)重要。將熒光染料與自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等成像工具結(jié)合使用，是評(píng)估細(xì)胞核質(zhì)量的有效方法。在眾多熒光染料中，選擇組合以評(píng)估核質(zhì)量對(duì)于確保結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。
此外，隨著現(xiàn)代自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（如點(diǎn)成LUNA-FX7™和點(diǎn)成LUNA-FL™）功能日益強(qiáng)大，深入了解這些系統(tǒng)在不同熒光染料組合下的表現(xiàn)顯得尤為必要。本研究旨在通過(guò)分析不同細(xì)胞類型、不同系統(tǒng)以及核固定條件下的熒光染料組合，找出的評(píng)估核質(zhì)量的方法。我們希望通過(guò)全面的分析，為單細(xì)胞基因組學(xué)研究中的核質(zhì)量評(píng)估程序提供優(yōu)化指導(dǎo)并提高評(píng)估的準(zhǔn)確性。
本研究使用了四種不同的熒光染料，且每種染料的最終濃度均有所不同：28 µM的嘧啶橙（AO），12.5 µM的鈣黃素（AM），15 µM的碘化丙啶（PI），以及20 µM的EthD-1。這些染料組合成AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1四種染料。每種組合取各染料1µL，總體積為2µL，隨后與18 µL細(xì)胞樣本混合。
實(shí)驗(yàn)旨在找出的染料組合，使用不同熒光染料評(píng)估U937細(xì)胞核和3T3細(xì)胞核的質(zhì)量。理論上，完整的細(xì)胞應(yīng)僅被膜透性染料（如AO和Calcein AM）選擇性染色。而去除膜后的分離細(xì)胞核則應(yīng)被非膜透性染料（如PI和EthD-1）染色，顯示出與死亡細(xì)胞類似的活性狀態(tài)。
在AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1這四種染料組合中，AO與PI或AO與EthD-1的組合能夠準(zhǔn)確顯示完整細(xì)胞和分離細(xì)胞核的活性（圖1A）。綠色和紅色信號(hào)的存在，使其能夠有效檢測(cè)U937細(xì)胞和3T3細(xì)胞的活性。然而，在3T3細(xì)胞中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到Calcein AM信號(hào)，而在U937細(xì)胞中約有三分之二的細(xì)胞顯示出Calcein AM信號(hào)（圖1B）。這種差異可以歸因于Calcein AM對(duì)酯酶活性的依賴性，而酯酶活性可能因不同細(xì)胞類型而異。因此，使用Calcein AM會(huì)遺漏部分完整細(xì)胞，從而降低活性評(píng)估的可靠性。
點(diǎn)成LUNA-FX7™ 和 點(diǎn)成LUNA-FL™系統(tǒng)是功能強(qiáng)大的分析平臺(tái)，能夠無(wú)縫捕獲明場(chǎng)圖像和熒光圖像，并通過(guò)熒光信號(hào)分析獲得細(xì)胞大小、活性和數(shù)量等寶貴數(shù)據(jù)。
評(píng)估分離核質(zhì)量時(shí)，可利用這些系統(tǒng)提供的平均細(xì)胞大小數(shù)據(jù)。例如，去除膜后的細(xì)胞核尺寸顯著小于完整細(xì)胞，這是因?yàn)槿コ?xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)會(huì)使細(xì)胞大小減少數(shù)微米。特別的是，點(diǎn)成LUNA-FL™和點(diǎn)成LUNA-FX7™能夠從明場(chǎng)圖像中提取細(xì)胞大小信息，因此能地避免因熒光強(qiáng)度可能引起的細(xì)胞大小測(cè)量偏差。這確保了在評(píng)估分離核質(zhì)量時(shí)，細(xì)胞大小測(cè)量的可靠性更高。
采用熒光染料檢測(cè)細(xì)胞活性是核質(zhì)量評(píng)估的另一個(gè)有用數(shù)據(jù)。如圖1所示，當(dāng)使用AO/PI或AO/EthD-1組合時(shí)，健康的完整細(xì)胞顯示接近99%的活性，而分離核顯示接近0%的活性值。像點(diǎn)成LUNA-FL™和點(diǎn)成LUNA-FX7™這樣的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀能夠在這些染料的作用下，準(zhǔn)確量化分離核的濃度（圖2）。這些結(jié)果提供了重要數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了核質(zhì)量，為后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
核固定是長(zhǎng)期保存的常見(jiàn)操作，因?yàn)樗兄诒４婕?xì)胞結(jié)構(gòu)并便于后續(xù)分析。因此，為驗(yàn)證上述核質(zhì)量評(píng)估方法是否適用于固定的核，我們使用AO/PI和AO/EthD-1對(duì)PFA固定的核進(jìn)行測(cè)試。使用AO/PI染料組合時(shí)，無(wú)論固定狀態(tài)或染料培養(yǎng)時(shí)間如何，均可觀察到明顯且強(qiáng)烈的PI熒光信號(hào)，這表明AO/PI染料可用于新鮮的分離核和固定核分析。然而使用AO/EthD-1時(shí)，固定核的EthD-1紅色熒光信號(hào)減少，即使延長(zhǎng)染料培養(yǎng)時(shí)間，熒光信號(hào)也沒(méi)有增加。為解決這一問(wèn)題，我們調(diào)整了自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的曝光值，將其從默認(rèn)的5增加到8。這一調(diào)整產(chǎn)生了更強(qiáng)的紅色信號(hào)，與AO/PI組合的效果相當(dāng)。這些結(jié)果表明，使用AO/EthD-1染料時(shí)，固定核的熒光信號(hào)會(huì)有所減弱，因此可能需要調(diào)整自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的參數(shù)。
在快速發(fā)展的單細(xì)胞基因組學(xué)研究領(lǐng)域，精確評(píng)估核質(zhì)量是實(shí)現(xiàn)可靠研究結(jié)果的基石。研究評(píng)估的染料組合中，AO/PI和AO/EthD-1在區(qū)分完整細(xì)胞與分離核的活性差異方面表現(xiàn)出色。值得注意的是，AO/PI對(duì)新鮮核和固定核均表現(xiàn)出良好的效果，而AO/EthD-1在固定核的應(yīng)用中需要優(yōu)化。本研究通過(guò)結(jié)合適當(dāng)?shù)娜玖辖M合與的點(diǎn)成LUNA-FX7™和點(diǎn)成LUNA-FL™系統(tǒng)，提出了一種高效且可靠的分離核質(zhì)量評(píng)估方法。這一成熟的方法為核質(zhì)量評(píng)估提供了寶貴的技術(shù)手段，從而推動(dòng)了單細(xì)胞基因組學(xué)研究的進(jìn)步。
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