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       生物標(biāo)志物是指人體產(chǎn)生的某些生物分子，與正常狀態(tài)相比，在疾病發(fā)展或藥物治療過(guò)程中表達(dá)量或受影響的程度不同。開(kāi)展臨床生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)涉及疾病早期篩查、鑒別診斷、藥物治療監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估等疾病相關(guān)的各個(gè)環(huán)節(jié)。生物標(biāo)志物的類(lèi)型包括蛋白質(zhì)、DNA、RNA 和代謝物等。其中，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物已經(jīng)在治療和診斷的發(fā)展中發(fā)揮了既定的作用。比如，急性炎癥可以通過(guò)測(cè)量血液中C反應(yīng)蛋白的水平來(lái)檢測(cè)，癌胚抗原（CEA）可以在一些患者中指示結(jié)腸癌的存在。對(duì)于一些疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS），沒(méi)有測(cè)試可以提供明確的診斷，并且疾病癥狀與其它神經(jīng)退行性疾病相似，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物有可能最終為患者提供答案。由于生物體的復(fù)雜多樣性，更多的情況下，單一或少量的生物標(biāo)志物往往無(wú)法反映機(jī)體的真實(shí)狀態(tài)，更準(zhǔn)確全面的評(píng)估需要結(jié)合更多生物標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果。

在發(fā)現(xiàn)潛在蛋白生物標(biāo)志物之后，需要通過(guò)靶向蛋白組學(xué)定量技術(shù)在大生物樣本量中，進(jìn)行高通量、高準(zhǔn)確性、可重復(fù)性的檢測(cè)，來(lái)驗(yàn)證這些標(biāo)志物。目前，靶向蛋白定量檢測(cè)技術(shù)主要包括免疫分析和質(zhì)譜分析。傳統(tǒng)的免疫法如ELISA，存在目標(biāo)物通量低、靈敏度有限、交叉反應(yīng)等不足，一些新型免疫檢測(cè)平臺(tái)則存在成本和技術(shù)門(mén)檻高、新方法開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。質(zhì)譜靶向檢測(cè)主要包括基于三重四極桿的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）方法。與MRM相比，PRM的優(yōu)勢(shì)在于它可以通過(guò)單次掃描即可監(jiān)測(cè)目標(biāo)母離子的所有產(chǎn)物離子，無(wú)需在數(shù)據(jù)采集之前預(yù)先設(shè)計(jì)母子離子對(duì)，簡(jiǎn)化了方法開(kāi)發(fā)工作流程，并且可提高檢測(cè)靈敏度。Heil等1在Orbitrap Eclipse質(zhì)譜儀上多次測(cè)量126個(gè)血漿蛋白中的432個(gè)肽，在高分辨率Orbitrap和單位分辨率線(xiàn)性離子阱（LIT）之間交替進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種質(zhì)量分析器具有相似的技術(shù)精度，并且線(xiàn)性離子阱的優(yōu)越靈敏度使其在超過(guò)62%的肽中測(cè)得更低的定量下限。

圖1. Orbitrap與LIT PRM檢測(cè)對(duì)比

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2024年ASMS大會(huì)上，賽默飛推出全新產(chǎn)品Thermo Scientific™ Stellar™質(zhì)譜儀。Stellar可通過(guò)四極桿和雙壓線(xiàn)性離子阱進(jìn)行PRM分析；其雙離子阱結(jié)構(gòu)允許同時(shí)進(jìn)行離子積累和碎裂，可提高譜圖采集速率，增加樣本檢測(cè)通量；并且可進(jìn)行MS3采集，克服復(fù)雜背景基質(zhì)干擾。

圖2. 傳統(tǒng)三重四極質(zhì)譜計(jì)與Stellar質(zhì)譜對(duì)比

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下面我們一起來(lái)看看Stellar發(fā)布以來(lái)在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方向的應(yīng)用研究報(bào)道結(jié)果。

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Remes等2對(duì)比了血漿基質(zhì)中786條多肽的三重四極桿和Stellar質(zhì)譜靶向定量檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與MRM檢測(cè)結(jié)果相比，Stellar PRM檢測(cè)的定量下限（LOQ）和檢測(cè)下限（LOD）分別提高了~10倍和~2倍，展現(xiàn)出更高的靈敏度。

圖3. MRM和Stellar PRM檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

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Plubell等3利用Orbitrap OE480或Stellar質(zhì)譜建立基質(zhì)樣本GPF-DIA蛋白組學(xué)譜圖庫(kù)；通過(guò)集成在skyline軟件中的PRM Conductor工具優(yōu)化每個(gè)precursor的色譜和質(zhì)譜參數(shù)，以及篩選precursor的m/z和相對(duì)保留時(shí)間；利用引入Adaptive RT功能的Stellar質(zhì)譜儀進(jìn)行篩選后precursors的PRM檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了利用Stellar進(jìn)行生物液體樣本高通量靶向蛋白檢測(cè)的方法（圖4）。在神經(jīng)退行性疾病病人來(lái)源的腦脊液樣本中進(jìn)行基于前期研究和GPF-DIA篩選得到的共101個(gè)蛋白（1070個(gè)precursors）的PRM檢測(cè)，通過(guò)Tau、APOE4等明確與AD相關(guān)的蛋白檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的可信度（圖5）；另外對(duì)病人血漿樣本進(jìn)行直接基于GPF-DIA篩選得到的共723個(gè)蛋白（2096個(gè)precursors）的PRM檢測(cè)，并成功驗(yàn)證出已報(bào)道的PD相關(guān)差異（圖6）。

圖4. 通過(guò)GPF-DIA建庫(kù)和PRM conductor篩選precursors建立Stellar高通量PRM分析方法的工作流程。

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圖5. 腦脊液樣本中神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的PRM測(cè)定結(jié)果。

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圖6. 建立富集血漿蛋白PRM檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)帕金森疾病相關(guān)差異。（點(diǎn)擊查看大圖）

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Wahle等4開(kāi)發(fā)報(bào)道了基于Orbitrap Astral的DIA數(shù)據(jù)建立Stellar PRM方法的分析策略（圖7），以及利用15N標(biāo)記蛋白在Stellar質(zhì)譜上開(kāi)發(fā)蛋白panel的準(zhǔn)確定量方法（圖8），使包括翻譯后修飾和突變?cè)趦?nèi)的蛋白質(zhì)形態(tài)的研究成為可能，展示出Stellar在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方面的能力和潛力。

圖7. 基于Orbitrap Astral DIA數(shù)據(jù)建立Stellar靶向分析方法

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圖8. 酒精肝panel蛋白15N標(biāo)記檢測(cè)

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小結(jié)

在蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)方面，Orbitrap Astral展示出強(qiáng)大的檢測(cè)通量和覆蓋深度，已經(jīng)使開(kāi)展大規(guī)模的臨床樣本檢測(cè)、發(fā)現(xiàn)新的潛在生物學(xué)標(biāo)志物成為可能。但如何有效驗(yàn)證和確認(rèn)高分辨質(zhì)譜揭示的成千上萬(wàn)的候選標(biāo)志物是目前實(shí)現(xiàn)生物標(biāo)志物臨床轉(zhuǎn)化的難點(diǎn)，讓我們一起期待Stellar質(zhì)譜在這一領(lǐng)域的精彩表現(xiàn)。