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菌種的誘變育種方法

要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大的改善，先必須選取性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。菌種選育包括根據(jù)菌種的自然變異而進(jìn)行的自然選育，以及根據(jù)遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和方法利用誘變育種技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程技術(shù)而進(jìn)行的誘變育種、細(xì)胞工程育種、基因工程育種等。

誘變育種

誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)研究用。誘變育種操作簡單、快速，是目前被廣泛使用的育種方法。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)所使用的生產(chǎn)菌株，大部分都是通過誘變育種提高了生產(chǎn)性誘變育種的基本過程包括出發(fā)菌株的選擇、單細(xì)胞或單孢子懸浮液的制備、誘變方法的選擇、誘變處理、篩選等。

1.出發(fā)菌株的選擇

用于誘變處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。誘變的目的是提高代謝終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的產(chǎn)量、質(zhì)量，或改變原有代謝途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。出發(fā)菌株的選擇直接關(guān)系到誘變效果。出發(fā)菌株應(yīng)選擇具備定生產(chǎn)能力或某種優(yōu)良特性的菌株，其遺傳性狀應(yīng)該是純的，有較高的生產(chǎn)能力，遺傳性狀穩(wěn)定，并對誘變劑敏感。

以下幾類菌株常用作出發(fā)菌株：類是從自然界直接分離得到的野生型菌株。這類菌株的特點(diǎn)是酶系完整，對誘變因素敏感，容易發(fā)生正突變（即產(chǎn)量和生產(chǎn)性狀向好的方向改變），但是他們的生產(chǎn)性能通常較差；二類是經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株。這類菌株已有定的生產(chǎn)性狀，對生產(chǎn)環(huán)境有較好的適應(yīng)性，容易發(fā)生正突變，在誘變育種中經(jīng)常采用；第三類是已經(jīng)歷過多次誘變處理的菌株。這類菌株的某些生理功能或酶系統(tǒng)有缺損，產(chǎn)量性狀已達(dá)到定的水平，繼續(xù)誘變?nèi)菀桩a(chǎn)生負(fù)突變，產(chǎn)量和性狀向差的方向改變。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，般可選擇類和第二類菌株，第三類菌株的應(yīng)用情況比較復(fù)雜，如果將每次誘變處理后選出的性狀較好的菌株作為出發(fā)菌株，繼續(xù)誘變處理，也有可能得到好的結(jié)果。

2.單細(xì)胞或單孢子懸浮液的制備

菌懸液般要求菌體處于對數(shù)生長期，保持懸液的均性，并采取定的措施使細(xì)胞盡可能處于同步生長狀態(tài)。為了保證誘變劑與每個(gè)細(xì)胞機(jī)會均等并充分地接觸，避免細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，可用玻璃珠振蕩打散細(xì)胞團(tuán)，再用脫脂棉花或?yàn)V紙過濾，得到分散的菌體。對產(chǎn)芽孢的細(xì)菌好采用其芽孢制備懸液；對放線菌和霉菌好采用其孢子。

般真菌孢子或酵母菌細(xì)胞懸液的濃度為106~1010個(gè)-mL-1，放線菌或細(xì)菌為108個(gè)·mL-1。菌懸液般用生理鹽水或緩沖溶液稀釋。對于會引起ph變化的誘變劑，般使用緩沖溶液稀釋。利用單細(xì)胞或單孢子懸浮液進(jìn)行誘變處理的優(yōu)點(diǎn)是能使分散狀態(tài)的細(xì)胞均勻地接觸誘變劑，盡可能避免出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，從而避免出現(xiàn)不純的菌落或者些優(yōu)良的變異菌株在篩選時(shí)被錯(cuò)誤淘汰。

3.誘變方法的選擇

誘變方法的選擇通常是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)。對于之前已發(fā)生過誘變的菌株，改變誘變劑的種類或許會有較好的效果。在眾多的誘變劑中，亞硝酸、硫酸二乙酯等會引起堿基置換，較易發(fā)生回復(fù)突變；紫外線、60Co和吖啶類物質(zhì)等會引起染色體畸變、移碼突變，不易回復(fù)，可得到突變性狀較穩(wěn)定的菌株。

誘變育種中還常常采取誘變劑復(fù)合處理，這種處理方法往往能使它們產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，般較單處理效果好。這是因?yàn)槊糠N誘變劑有各自的作用方式，引起的變異有局限性，復(fù)合處理則可擴(kuò)大突變的位點(diǎn)范圍，使獲得正突變菌株的可能性增大。復(fù)合處理可以將兩種或多種誘變劑分先后或同時(shí)使用，也可重復(fù)使用同誘變劑。

4.誘變處理

誘變劑的作用是提高突變的頻率，二是擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度，三是使產(chǎn)量變異朝正突變或負(fù)突變的方向移動。凡是在高突變率基礎(chǔ)上既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正突變范圍的劑量，就是合適的劑量，需多次試驗(yàn)后確定。

不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感性不同，所以在誘變處理前，般應(yīng)先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。般以導(dǎo)致微生物的死亡率在70%~80%為佳誘變劑量。死亡率表示誘變劑造成菌懸液中死亡菌體數(shù)占菌體總數(shù)的比率。不同誘變劑的劑量有不同表示方法，如紫外線和X射線是以強(qiáng)度來表示，化學(xué)誘變劑以在定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來表示。但是，僅僅采用理化指標(biāo)控制誘變劑的用量常會造成偏差，不利于重復(fù)操作。例如，同樣功率的紫外線照射誘變效應(yīng)還受到紫外燈的質(zhì)量及其預(yù)熱時(shí)間，燈與被照射物的距離，照射時(shí)間，菌懸液的濃度、厚度及均勻程度等諸多因素的影響。